Forskel mellem genkloning og PCR
Share
Nøgleforskel - Genkloning vs PCR
Syntesen af mange kopier af DNA fra et specifikt DNA-fragment kaldes DNA-amplifikation. Der er to vigtigste DNA-amplificeringsprocesser, nemlig genkloning og PCR. Den vigtigste forskel mellem genkloning og PCR er, genkloning producerer de flere kopier af et specifikt gen in vivo ved at konstruere et rekombinant DNA og dyrke inde i en værtsbakterie, mens PCR producerer millioner af kopier af et specifikt DNA-fragment in vitro gennemgår gentagne cykler af denaturering og syntese.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er genkloning
3. Hvad er PCR
4. Sammenligning side ved side - Genkloning vs PCR
5. Resume
Hvad er genkloning?
Genkloning er en teknik, der anvendes til at lokalisere og multiplicere et specifikt gen fra det ekstraherede genomiske DNA fra en organisme gennem konstruktionen af rekombinant DNA. Genomisk DNA indeholder tusinder af forskellige gener kodet for proteiner. Når DNA ekstraheres, inkluderer det alle mulige gener, det kan bære. Genkloningsteknik har muliggjort påvisning af et specifikt gen fra det samlede DNA. Derfor fungerer genkloning som et vigtigt redskab i molekylærbiologi.
Fremstilling af et genomisk bibliotek af en organisme er essentielt ved genkloning, hvis der ikke er nogen anelse om placeringen af det relevante gen i DNA'et. Et genomisk bibliotek fremstilles ved hjælp af de følgende trin.
Trin 1: Ekstraktion af det totale DNA fra en organisme, der indeholder det ønskede gen.
Trin 2: Begrænsningsfordøjelse af det ekstraherede DNA til frembringelse af små håndterbare fragmenter. Dette trin letter det ved hjælp af restriktionsendonukleaser.
Trin 3: Valg af en passende vektor og åbning af vektor-DNA'et ved anvendelse af de samme restriktionsendonukleaser. Bakterielle plasmider anvendes ofte som vektorer til at bære fremmed DNA. Plasmider er små cirkler af DNA placeret i bakterier.
Trin 4: Kombination af vektor-DNA og fragmenteret DNA til frembringelse af rekombinant DNA-molekyle. Dette trin styres af DNA-ligase.
Trin 5: Overførsel af rekombinante DNA-molekyler til værtsbakterier. Dette trin er kendt som transformation og udføres ved hjælp af et varmechok.
Trin 5: Screening af transformerede bakterieceller på et kulturmedium. En blandet population af transformerede og ikke-transformerede værtsceller opnås ved afslutningen af transformationsprocessen. Som gen af interesse inkluderer kun transformerede værtsceller. Derfor er det nødvendigt at vælge transformerede celler. Valget foretages ved hjælp af selektive medier, der indeholder antibiotika. Kun de transformerede celler vokser på dette screeningsmedium, hvilket muliggør markeringen.
Trin 6: Dyrkning af bakterier til produktion af et genbibliotek. I dette trin indføres de transformerede værtsceller i friske dyrkningsmedier, som tilvejebringer optimale vækstkrav. Samlede kolonier på kulturpladerne repræsenterer det organiske genomiske bibliotek.
Trin 7: Det rekombinante DNA-molekyle, der indeholder genet af interesse, skal screenes fra tusinder af klonede fragmenter af rekombinant DNA. Det kan opnås ved anvendelse af sonder, der markerer det specifikke gen eller det specifikke proteinresultat fra dette gen.
Når det interesserede gen, der indeholder bakteriekolonien, er identificeret fra de samlede kolonier, er det muligt at fremstille millioner af kopier af det rekombinante plasmid, der indeholder genet.
Genkloning bruges til at etablere genbiblioteker, fremstille specielt protein, vitaminer, antibiotika, hormoner, sekventering og kortlægning af genomer af organismerne, ved at fremstille flere kopier af individer DNA i retsmedicin osv..
Figur_1: Genkloning
Hvad er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en teknik, der genererer et stort antal kopier af et bestemt DNA-fragment. Eksponentiel amplifikation af en specifik DNA-sekvens opnås ved PCR under in vitro betingelser. Denne teknik er et meget kraftfuldt værktøj inden for molekylærbiologi, da den kan multiplicere en lille DNA-prøve til en anvendelig mængde. PCR blev introduceret af Kary Mullis i 1983, og denne prisvindende opfindelse skabte en enorm fremgang inden for molekylærbiologi.
PCR-teknik følger gentagne PCR-reaktioner som vist i figur 02. Én PCR-reaktion består af tre hovedtrin, der forekommer ved tre forskellige temperaturer; denaturering af dobbeltstrenget ved DNA ved 94 0C, annealing af primerne ved 68 0C og strengforlængelse ved 72 0C. Når PCR udføres, bør temperatursvingninger derfor opretholdes stærkt for korrekt replikation. PCR udføres i en PCR-maskine inde i PCR-rør. PCR-rør er fyldt med korrekte PCR-blandinger indeholdende templat-DNA, Taq-polymerase, primere, dNTP'er og buffer. Denaturering af dobbeltstrenget prøve-DNA til enkeltstrenget DNA udføres ved at bryde hydrogenbindingerne mellem komplementære baser ved 94 - 98 0C. Derefter udsættes enkeltstrenge af skabelon-DNA for primere. Der skal være et par primere (frem og tilbage), og de skal være termostabile til at tolerere høje temperaturer. Primere er enkeltstrengede korte DNA-sekvenser komplementære til enderne af mål-DNA-fragmentet. Syntetiske primere bruges i PCR. Primere binder til de komplementære baser af prøve-DNA og initierer syntesen af en ny streng. Dette trin katalyseres af et enzym kaldet Taq-polymerase; et termostabilt DNA-polymeraseenzym isoleret fra Thermus auqaticus. Når primere og nucleotider (byggesten) er tilgængelige, konstruerer Taq-polymerase den nye streng af DNA, der er komplementær til skabelon-DNA. Ved afslutningen af PCR-programmet observeres amplificeret DNA-fragment under anvendelse af gelelektroforese. Hvis yderligere analyse er påkrævet, oprenses PCR-produkt fra gelen.
PCR er meget nyttigt til diagnosticering og overvågning af genetiske og erhvervede sygdomme, identifikation af kriminelle (inden for retsmedicin), undersøgelse af strukturen og funktionen af et målrettet DNA-segment, sekventering og kortlægning af genomer af organismer osv. PCR er blevet en rutinemæssig laboratorieteknik i medicinske og molekylærbiologiske forskningslaboratorier blandt forskere, da det har en lang række anvendelser.
Figur_2: Polymerase-kædereaktion
Hvad er forskellen mellem genkloning og PCR?
Genkloning vs PCR | |
| Genkloning er processen til at fremstille flere kopier af et specifikt gen in vivo gennem rekombinant DNA og transformering til en værtsbakterie. | PCR-teknikken producerer flere kopier af en bestemt DNA-sekvens in vitro gennem gentagne cyklusser af PCR-reaktioner. |
| Krav til konstruktion af rekombinant DNA | |
| Rekombinant DNA produceres for at lokalisere genet. | Rekombinant DNA produceres ikke. |
| Behov for arbejdskraft | |
| Denne proces er arbejdskrævende. | Intensiv arbejdskraft er ikke nødvendig. |
| In vivo eller in vitro-proces | |
| Konstruktion af rekombinant DNA er in vitro og amplificeringen af DNA er in vivo. | Opformeringen af DNA sker fuldstændigt in vitro. |
Resume - Genkloning vs PCR
Genkloning og PCR er to metoder, der anvendes til DNA-amplifikation. PCR er en in vitro fremgangsmåde, der fremstiller flere kopier af DNA af et bestemt DNA-fragment uden anvendelse af rekombinant DNA og en værtsorganisme. Genkloning er primært en in vivo proces, som resulterer i flere kopier af et interesseret gen inde i værtsorganismen via konstruktion af rekombinant DNA. Dette er forskellen mellem genkloning og PCR.
Reference:
1. Griffiths, Anthony JF. “Kloning af en bestemt gen.” Moderne genetisk analyse. U.S. National Library of Medicine, 1. januar 1999. Web. 22. februar 2017
2. ”Polymerasekædereaktion (PCR).” National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine, n.d. Web. 22. februar 2017
Billede høflighed:
1. “Figur 17 01 06” Af CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia
2. “PCR” af Madprime - Eget arbejde (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
