Forskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger Sequencing

Nøgleforskel - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

Nukleotider er de grundlæggende strukturelle enheder og byggeblokke af DNA. DNA-molekyle er sammensat af en polynukleotidkæde. Der findes fire forskellige nukleotider i DNA. Disse nukleotider er sammensat af fire forskellige nitrogenholdige baser benævnt A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (thymin). Ordenen af nukleotiderne i DNA-molekylet har en stor betydning, da den koder for en vigtig genetisk information til vækst og udvikling af organismer. DNA-sekventering henviser til processen, der bestemmer den nøjagtige nucleotidsekvens af DNA'et. Der er forskellige DNA-sekventeringsmetoder. Maxam Gilbert-sekventering og Sanger-DNA-sekventering er to metoder til DNA-sekventering, der hører til første generations sekventering. Maxam Gilbert-sekventeringsprocedure bestemmer basesekvensen ved kemisk spaltning af 5'-ende-mærkede DNA-fragmenter fortrinsvis ved hver af fire nukleotider og gelelektroforese. Sanger-sekventeringsprocedure bestemmer nukleotidsekvensen ved syntese af enkeltstrenget DNA ved anvendelse af DNA-polymerase og dideoxynukleotider og gelelektroforese. Dette er den vigtigste forskel mellem Maxam Gilbert og Sanger Sequencing.

INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er Maxam Gilbert
3. Hvad er Sanger Sequencing
4. Sammenligning side ved side - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
5. Resume

Hvad er Maxam Gilbert Sequencing?

Maxam Gilbert-sekventering, også kendt som kemisk sekventeringsmetode, er en teknik, der blev udviklet til at bestemme rækkefølgen af nukleotiderne i DNA. Denne metode blev introduceret af Walter Gilbert og Alan Maxam i 1976 og blev populær, da den kan udføres direkte med oprenset DNA. Maxam Gilbert-metoden hører til den første generation af DNA-sekventering, og det var den første sekventeringsmetode, der blev anvendt vidt af forskere.

Det grundlæggende princip i denne metode ligger i begrænsningen af de endemærkede DNA-fragmenter ved specifikke baser ved basespecifikke kemikalier og betingelser og adskillelse af de mærkede fragmenter ved hjælp af elektroforese som vist i figur 01. Fragmenter adskilles efter deres størrelse på gel. Da fragmenterne er mærket, kan DNA-molekylets sekvens let udledes.

Maxam gilbert-metoden bruger basespecifikke kemikalier til at nedbryde DNA ved specifikke baser. To almindelige kemikalier benævnt dimethylsulfat og hydrazinkemikalier anvendes til selektiv angreb på henholdsvis puriner og pyrimidiner.

Maxam Gilbert sekventeringsmetode udføres via flere trin som følger.

Oprensning af DNA-sekvensen under anvendelse af restriktionsendonukleaser
Mærkning af enderne af DNA-fragmenterne ved tilsætning af radioaktive phosphater
Oprensning af de mærkede fragmenter fra ikke-mærkede fragmenter ved gelelektroforese
Adskillelse af det endemærkede DNA i fire rør og behandling med basespecifikke kemikalier separat
Elektroforese af indholdet af hvert rør på separate linjer på en gel og fragmentadskillelse efter deres længde.
Påvisning af fragmenterne ved autoradiograf.

Figur 01: Maxam Gilbert Sequencing

Hvad er Sanger Sequencing?

Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 til bestemmelse af basesekvensen for et givet DNA-fragment. Det er også kendt som sekvensering af kædetermination eller Dideoxy-sekventeringsmetode. Denne fremgangsmåde fungerer på princippet om selektiv inkorporering af kædeterminerende dideoxynukleotider (ddNTP'er), såsom ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP ved hjælp af DNA-polymerase under syntesen af enkeltstrenget DNA for at afslutte dannelse af streng. Dideoxynukleotider mangler 3 'OH-grupper til dannelse af phosphodiesterbindinger med tilstødende nukleotid. Derfor stopper strengdannelsen, når en ddNTP er inkorporeret i nyligt dannende streng under sanger-sekventering.

I denne metode udføres fire separate DNA-syntesereaktioner (PCR) i fire separate rør med en type ddNTP. Andre krav stilles også til rørene til PCR inklusive primere, dNTP'er, Taq-polymerase, specifikke betingelser osv. Fire separate reaktioner udføres i fire rør med fire blandinger. Efter PCR-reaktioner bliver de resulterende DNA-fragmenter denatureret og separeret ved gelelektroforese. Derefter visualiseres fragmenterne ved anvendelse af enten en mærket (radioaktiv eller fluorescerende) primer eller dNTP'er som vist i figur 02.

Figur 02: Sanger Sequencing

Hvad er forskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger Sequencing?

Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert-sekventering er den første teknik udviklet til DNA-sekventering.	Sanger-sekventeringsmetode blev introduceret efter Maxam Gilbert-sekventeringsmetoden.
Anvendelse
Denne metode bruges sjældent.	Sanger-sekventering anvendes rutinemæssigt til sekventering.
Brug af farlige kemikalier
Det bruger farlige kemikalier.	Brug af farlige kemikalier er begrænset sammenlignet med Maxam Gilbert-metoden.
Mærkning til detektion
Denne metode bruger radioaktivt P³² til mærkning af enderne af DNA-fragmenterne.	Sanger-sekventering bruger radioaktivt eller fluorescerende mærkede ddNTP'er.

Resume - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

Maxam Gilbert og Sanger-sekventering er to typer DNA-sekventeringsteknikker, der hører under første generation af DNA-sekventering. Maxam Gilbert-sekventering er den første metode introduceret til DNA-sekventering i 1976, og den udføres ved at bryde de ende-mærkede DNA-fragmenter med basespecifikke kemikalier. Derfor er det kendt som kemisk sekventering. Sanger-sekventeringsmetode blev introduceret i 1977 og er baseret på de ddNTP-drevne kædetermineringsreaktioner. Sanger-sekventeringsmetode, der er populær end Maxam Gilbert-metoden på grund af flere ulemper ved Maxam Gilbert-metoden, såsom overdreven tidsforbrug, brug af farlige kemikalier osv. Dette er forskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger-sekventering.

Referencer:
1.Maxam, A. M, og Walter Gilbert. ”En ny metode til sekventering af DNA.” Proces of the National Academy of Sciences. National Acad Sciences, 9. december 1976. Web. 30. mar. 2017
2.Heather, James M. og Benjamin Chain. "Sekvensen af sekventer: Historien om sekventering af DNA." Genomics. Academic Press, jan. 2016. Web. 30. mar. 2017
3.Pareek, Chandra Shekhar, Rafal Smoczynski og Andrzej Tretyn. “Sekventeringsteknologier og genomsekventering.” Journal of Applied Genetics. Springer-Verlag, nov. 2011. Web. 30. mar. 2017

Billede høflighed:
1. “Maxam gilbert sequencing” af adskillige gange på engelsk Wikipedia (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia
2. “Sanger-sequencing” Af Estevezj - Eget arbejde (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia

Videnskab & natur