Forskel mellem NGS og Sanger Sequencing
Share
Nøgleforskel - NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) og Sanger Sequencing er to typer nukleotidsekventeringsteknikker udviklet over tid. Sanger Sequencing-metode blev brugt i mange år, og NGS erstattede den for nylig på grund af dens fordele. Den vigtigste forskel mellem NGS og Sanger Sequencing er den NGS arbejder på princippet om sekventering af millioner af sekvenser samtidigt på en hurtig måde gennem et sekvenseringssystem, mens Sanger Sequencing fungerer på hovedet ved kædeafslutning på grund af selektiv inkorporering af dideoxynukleotider med DNA-polymeraseenzym under DNA-replikationen og resulterende fragmentadskillelse ved kapillær elektroforese.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er nukleotidsekventering
3. Hvad er NGS
4. Hvad er Sanger Sequencing
5. Sammenligning side ved side - NGS vs Sanger Sequencing
6. Resume
Hvad er nukleotidsekventering?
Genetisk information gemmes i nukleotidsekvenserne af DNA eller RNA i en organisme. Processen til bestemmelse af den korrekte rækkefølge af nukleotider (ved anvendelse af fire baser) i et givet fragment (i et gen, en klynge af gener, kromosom og komplet genom) er kendt som nukleotidsekvensering. Det er meget vigtigt i genomiske undersøgelser, retsmedicinske undersøgelser, virologi, biologisk systematisk, medicinsk diagnose, bioteknologi og på mange andre områder at analysere strukturen og funktionen i gener. Der er forskellige typer sekventeringsmetoder udviklet af forskere. Blandt dem, Sanger sekventering udviklet af Frederick Sanger i 1977 blev vidt brugt og populariseret i en lang periode indtil Next Generation Sequencing erstattet den.
Hvad er NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) er et udtryk, der bruges til at referere til moderne sekvenseringsprocesser med høj kapacitet. Den beskriver en række forskellige moderne sekventeringsteknologier, der revolutionerede genomiske undersøgelser og molekylærbiologi. Disse teknikker er Illumina-sekventering, Roche 454-sekventering, Ion Proton-sekventering og SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) -sekventering. NGS-systemer er hurtigere og billigere. Fire vigtigste DNA-sekventeringsmetoder anvendes i NGS-systemer, nemlig; pyrosequencing, sekventering ved syntese, sekventering ved ligering og ion semiconductorsekvensering. Et stort antal DNA- eller RNA-strenge (millioner af) kan sekventeres parallelt. Det muliggør sekventering af hele genomet af organismer inden for en kort tidsperiode, i modsætning til Sanger-sekventering, der tager mere tid.
NGS har mange fordele i forhold til konventionel sekventering Sanger-metode. Det er en højhastigheds, mere nøjagtig og omkostningseffektiv proces, der kan udføres med en lille prøvestørrelse. NGS kan anvendes i metagenomiske undersøgelser, til påvisning af variationer i et individuelt genom på grund af insertioner og deletioner osv. Og til analyse af genudtryk.
Figur_1: Udviklingen i NGS-sekvens
Hvad er Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for at bestemme den nøjagtige nukleotidrekkefølge for et givet DNA-fragment. Det er også kendt som sekvensering af kædetermination eller Dideoxy-sekventering. Arbejdsprincippet for denne metode er afslutningen af strengsyntesen ved selektiv inkorporering af en kædeterminerende dideoxynukleotider (ddNTP'er), såsom ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP med DNA-polymerase under replikationen af DNA. Normale nukleotider har 3 'OH-grupper til dannelse af en phosphodiesterbinding mellem tilstødende nukleotider for at fortsætte strengdannelsen. Imidlertid mangler ddNTP'er denne 3 'OH-gruppe og er ikke i stand til at danne phosphodiesterbindinger mellem nukleotider. Derfor er kædeforlængelsen ophørt.
I denne metode tjener det enkeltstrengede DNA, der skal sekventeres, som templatestrengen for in vitro DNA-syntese. Andre krav er oligonukleotidprimer, deoxynukleotidforstadier og DNA-polymeraseenzym. Når de flankerende ender af målfragmentet er kendt, kan primere let designes til DNA-replikation. Fire separate DNA-syntesereaktioner udføres i fire separate rør. Hvert rør har separate ddNTP'er sammen med andre krav. Fra det bestemte nucleotid tilsættes en blanding af dNTP'er og ddNTP'er. Ligeledes udføres fire separate reaktioner i fire rør med fire blandinger. Efter reaktionerne udføres påvisning af DNA-fragmenter og omdannelse af fragmentmønsteret til sekvensinformation. De resulterende DNA-fragmenter blev denatureret varme og separeret ved gelelektroforese. Hvis der anvendes radioaktive nukleotider, kan båndmønsteret i polyacrylamidgelen visualiseres ved autoradiografi. Når denne metode anvender de fluorescerende mærkede dideoxynukleotider, kan den dæmpes ned af gelen aflæst og ledes gennem en laserstråle, der kan detekteres af den fluorescerende detektor. For at undgå fejl, der kan opstå, når en sekvens læses af øjet og indtastes manuelt på en computer, udviklede denne metode sig til brug af automatiseret sequencer koblet til computeren.
Dette er den metode, der bruges til sekvensering af DNA fra Human Genome-projektet. Denne metode er stadig i brug med avancerede ændringer, fordi den giver nøjagtige sekvensoplysninger på trods af at det er en dyr og langsom proces.
Figur_2: Sanger-sekventering
Hvad er forskellen mellem NGS og Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing | |
| Next Generation Sequencing (NGS) henviser til moderne sekvenseringsprocesser med høj kapacitet. Den beskriver en række forskellige moderne sekventeringsteknologier | Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger til bestemmelse af den nøjagtige nukleotidrekkefølge for et givet DNA-fragment. |
| Omkostningseffektivitet | |
| NGS er en billigere proces, fordi det reducerer tid, menneskekraft og kemikalier. | Dette er en kostbar proces, fordi det tager tid, menneskekraft og flere kemikalier. |
| Hastighed | |
| Dette er hurtigere, da både kemisk detektion og signaldetektion af mange strenge sker parallelt. | Dette er tidskrævende, da kemisk detektion og signaldetektion sker som to separate processer og kun på streng kan læses ad gangen. |
| Pålidelighed | |
| NGS er pålidelig. | Sanger-sekventering er mindre pålidelig |
| Prøvestørrelse | |
| NGS kræver mindre mængde DNA. | Denne metode har brug for en stor mængde skabelon-DNA. |
| DNA-baser pr. Sekventeret fragment | |
| Antallet af DNA-baser pr. Sekventeret fragment er lavere end Sanger-metoden | Generering af sekvenser er længere end NGS-sekvenser. |
Resume - NGS vs Sanger Sequencing
NGS og Sanger Sequencing er nukleotidsekventeringsteknikker, der i vid udstrækning anvendes i molekylærbiologi. Sanger sequencing er en tidlig sekventeringsmetode, som blev erstattet af NGS. Den største forskel mellem NGS og Sanger Sequencing er, at NGS er en høj hastighed, mere nøjagtig og omkostningseffektiv proces end Sanger sekventering. Begge teknikker skabte store udbrud inden for genetik og bioteknologi.
Reference:
1. Nowrousian, Minou. "Next-generations sekventeringsteknikker til eukaryote mikroorganismer: Sekventeringsbaserede løsninger til biologiske problemer." Eukaryotisk celle. American Society for Microbiology, Sept. 2010. Web. 18. februar 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen og A. R. Coulson. "DNA-sekventering med kædeterminerende hæmmere." Proceedings of the National Academy of Sciences 74.12 (1977): 5463-467. Web.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu og Maggie Law. "Sammenligning af sekvenseringssystemer til næste generation." Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. Web.
Billede høflighed:
“Sanger-sequencing” Af Estevezj - Eget arbejde (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
“Udviklingen i næste generations sekventering” Af Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia
