Forskel mellem Northern Southern og Western Blotting

Nøgleforskel - Northern vs Southern vs Western Blotting
 

Påvisning af specifikke sekvenser af DNA, RNA og proteiner er vigtig for forskellige typer undersøgelser inden for molekylærbiologi. Gelelektroforese er en teknik, der adskiller DNA, RNA og proteiner i henhold til deres størrelse. Fra gelprofilerne detekteres særlig DNA-sekvens, RNA-sekvens eller protein ved hjælp af de specielle teknikker kaldet blotting og hybridisering med mærkede prober. Der er tre forskellige typer blottingmetoder, nemlig sydlige, nordlige og vestlige. Den vigtigste forskel mellem den nordlige sydlige og den vestlige blotting ligger i den type molekyle, det registrerer fra en prøve. Sydlig blotting er en metode, der detekterer en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Northern blotting er en teknik, der detekterer en specifik RNA-sekvens fra en RNA-prøve. Western blotting er en metode, der detekterer et specifikt protein fra en proteinprøve.

INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er Southern Blotting
3. Hvad er Northern Blotting
4. Hvad er Western Blotting
5. Sammenligning side ved side - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Resume

Hvad er Southern Blotting?

Southern blotting-teknik blev udviklet af E. M. Southern i 1975 til identifikation af en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Dette er den første blotting-teknik introduceret i molekylærbiologi. Det muliggjorde påvisning af specifikke gener fra DNA'et, specifikke fragmenter fra DNA osv. Der er flere trin involveret i den sydlige blotting-teknik. De er som følger.

1. DNA isoleres fra prøven og spaltes med restriktionsendonukleaser.
2. Fordøjet prøve adskilles ved Agarosegelelektroforese.
3. DNA-fragmenter i gelen denatureres i enkeltstrenge ved anvendelse af en alkalisk opløsning.
4. Enkeltstrenget DNA overføres til en nitrocellulosefiltermembran ved kapillæroverførsel.
5. Overført DNA fastgøres permanent på membranen.
6. Fast DNA på membranen hybridiseres med mærkede sonder.
7. Ubundet DNA vaskes fra membranen ved vask.
8. Røntgenfilm udsættes for membranen, og der fremstilles en autoradiograf.

Sydlig blotting anvendes til forskellige aspekter af molekylærbiologi. Det er nyttigt ved RFLP-kortlægning, retsmedicinske undersøgelser, DNA-methylering i genekspression, påvisning af muterede gener ved genetiske lidelser, DNA-fingeraftryk osv..

Figur 01: Southern Blotting Technique

Hvad er Northern Blotting?

Northern blotting er en metode designet til at detektere en specifik RNA-sekvens eller mRNA-sekvens fra en prøve til undersøgelse af genekspression. Denne teknik blev udviklet af Alwine, Kemp og Stark i 1979. Den adskiller sig fra den nordlige og den vestlige blotting-teknik på grund af flere trin. Denne teknik udføres imidlertid også via gelelektroforese, blotting og hybridisering med specifikke mærkede prober og detektion. Northern blotting teknik udføres som følger.

1. RNA ekstraheres fra prøven og separeres ved gelelektroforese.
2. RNA overføres fra gelen til en blottingmembran og fikseres.
3. Membranen behandles med en mærket probe fremstillet ud fra cDNA eller RNA (proben er komplementær til en specifik sekvens i prøven).
4. Proben inkuberes med membranen for at binde med en specifik sekvens.
5. Ubundne sonder vaskes.
6. Hybridiserede fragmenter detekteres ved hjælp af et autoradiograf.

Northern blotting er et vigtigt værktøj til påvisning og kvantificering af hybridiseret mRNA, undersøgelse af RNA-nedbrydning, evaluering af RNA-halveringstid, påvisning af RNA-splejsning, undersøgelse af genekspression osv..

Figur 02: Northern Blotting

Hvad er Western Blotting?

Western blotting er en metode til påvisning af et specifikt protein fra en proteinblanding ved anvendelse af mærket antistof. Derfor er western blot også kendt som en immunoblotanalyse. Denne teknik blev introduceret af Towbin et al i 1979, og det udføres nu rutinemæssigt i laboratorierne til proteinanalyse. Trin er som følger.

1. Proteiner ekstraheres fra prøven
2. Proteiner adskilles efter deres størrelse ved anvendelse af polyacrylamidgelelektroforese
3. Separerede molekyler overføres til en PVDF-membran eller nitrocellulosemembran ved elektroporation
4. Membranen er blokeret for ikke-specifik binding med antistofferne
5. Overførte proteiner er bundet med primært antistof (enzymmærkede antistoffer).
6. Membranen vaskes for at fjerne ikke-specifikt bundne primære antistoffer
7. Bundne antistoffer detekteres ved tilsætning af et substrat og detektion af det dannede farvede bundfald

Western blotting er nyttigt til påvisning af anti-HIV-antistoffer i en human serumprøve. Western blot kan også bruges som en bekræftende test for hepatitis B-infektion og som en endelig test for madko-sygdom.

Figur 03: Western Blotting

Hvad er forskellen mellem Northern Southern og Western Blotting?

Northern vs Southern vs Western Blotting
Type molekyle fundet
Northern Blotting	Northern blotting detekterer en specifik RNA-sekvens fra en RNA-prøve.
Southern Blotting	Sydlig blotting detekterer en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve.
Western Blotting	Western blotting detekterer et specifikt protein fra en proteinprøve.
Gel type
Northern Blotting	Dette bruger Agarose / formaldehydgel.
Southern Blotting	Dette bruger en Agarose gel.
Western Blotting	Dette bruger polyacrylamidgel.
Blotting Metode
Northern Blotting	Dette er en kapillæroverførsel.
Southern Blotting	Dette er en kapillæroverførsel.
Western Blotting	Dette er en elektrisk overførsel.
Prober brugt
Northern Blotting	cDNA- eller RNA-prober mærket radioaktivt eller ikke-radioaktiv.
Southern Blotting	DNA-prober er mærket radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
Western Blotting	Primære antistoffer anvendes som sonder.
Detektionssystem
Northern Blotting	Dette gøres ved hjælp af en autoradiograf eller påvisning af lys eller farveændring.
Southern Blotting	Dette gøres ved hjælp af en autoradiograf, detektion af lys eller farveændring.
Western Blotting	Dette gøres ved at registrere detektering af lys eller farveændring.

Resume - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting er en speciel teknik udviklet til identifikation af specifikt DNA, RNA eller protein fra prøverne. Der er tre separate blottingprocedurer, nemlig nordlige, sydlige og vestlige, til at detektere en bestemt type molekyle. Northern blotting-teknik er designet til at detektere en specifik RNA-sekvens fra en blanding af RNA. Sydlig blotting-teknik muliggør detektion af en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve, og western blotting-teknik er udviklet til at identificere et specifikt protein fra en proteinblanding.

Referencer
1. Gibbons, Janay. “Western Blot: Protein Transfer Oversigt.” North American Journal of Medical Sciences. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, mar. 2014. Web. 27. mar. 2017
2. Brown, T. "Southern blotting." Aktuelle protokoller i immunologi. U.S. National Library of Medicine, maj 2001. Web. 27. mar. 2017
3. Han, Shan L. “Northern blot.” Metoder i enzymologi. U.S. National Library of Medicine, 2013. Web. 27. mar. 2017

Billede høflighed:
1. “Northern Blot Scheme” af RNA405 - Eget arbejde (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. “Western blot 114A” Af Amanthabagdon - Eget arbejde (Public Domain) via Commons Wikimedia