Forskellen mellem Sanger Sequencing og Pyrosequencing
Share
Nøgleforskel - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNA-sekventering er meget vigtig til DNA-analyse, da viden om det korrekte nucleotidarrangement på en bestemt DNA-region afslører mange vigtige oplysninger om det. Der er forskellige DNA-sekventeringsmetoder. Sanger sekventering og Pyrosequencing er to forskellige DNA sekventeringsmetoder, der i vid udstrækning anvendes i molekylærbiologi. Den vigtigste forskel mellem Sanger sequencing og Pyrosequencing er den Sanger-sekventering bruger dideoxynukleotider til at afslutte syntesen af DNA til at læse nukleotidsekvensen, mens pyrosekvænkning detekterer pyrophosphatfrigivelsen ved at inkorporere nukleotiderne og syntetisere den komplementære sekvens for at læse den nøjagtige rækkefølge af sekvensen.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er Sanger Sequencing
3. Hvad er Pyrosequencing
4. Sammenligning side ved side - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
5. Resume
Hvad er Sanger Sequencing?
Sanger sequencing er en første generation af DNA sequencing metode udviklet af Frederick Sanger og hans colleges i 1977. Det er også kendt som Sekvensering af kædetermination eller Dideoxy-sekventering da det er baseret på kædeafslutning med dideoxynucleotides (ddNTP'er). Denne metode blev vidt brugt i mere end 30 år, indtil New Generation Sequencing (NGS) blev udviklet. Sanger-sekventeringsteknik muliggjorde opdagelsen af den korrekte nukleotidrekkefølge eller tilknytningen af et bestemt DNA-fragment. Det er baseret på den selektive inkorporering af ddNTP'er og afslutning af DNA-syntese i løbet af in vitro DNA-replikation. Fraværet af 3 'OH-grupper for at fortsætte dannelsen af phosphodiesterbinding mellem tilstødende nukleotider er et unikt træk ved ddNTP'er. Når først ddNTP er knyttet, ophører kædeudvidelsen og afsluttes fra dette punkt. Der er fire ddNTP'er - ddATP, ddCTP, ddGTP og ddTTP - brugt i Sanger-sekventering. Disse nukleotider stopper DNA-replikationsprocessen, når de inkorporeres i den voksende streng af DNA og resulterer i forskellige længder af kort DNA. Kapillærgelelektroforese bruges til at organisere disse korte DNA-strenge efter deres størrelse på en gel som vist i figur 01.
Figur 1: Kapillær gelelektroforese af syntetiseret kort DNA
Til in vitro replikation af DNA, få krav bør stilles. De er DNA-polymeraseenzym, skabelon-DNA, oligonukleotidprimere og deoxynukleotider (dNTP'er). Ved Sanger-sekventering udføres DNA-replikation i fire separate prøverør sammen med fire typer ddNTP'er hver for sig. Deoxynukleotider erstattes ikke fuldstændigt med de respektive ddNTP'er. En blanding af det bestemte dNTP (for eksempel; dATP + ddATP) er inkluderet i røret og replikeret. Fire separate rørprodukter køres på en gel i fire separate brønde. Ved derefter at læse gelen kan sekvensen konstrueres som vist i figur 02.
Figur 02: Sanger-sekventering
Sanger-sekventering er en vigtig teknik, der hjælper i mange områder af molekylærbiologi. Menneskeligt genomprojekt blev med succes afsluttet ved hjælp af Sanger-sekventeringsbaserede metoder. Sanger-sekventering er også nyttig i mål-DNA-sekventering, kræft- og genetisk sygdomsforskning, genekspressionsanalyse, human identifikation, patogen-detektion, mikrobiel sekventering osv..
Der er flere ulemper ved Sanger-sekventering:
- Længden af det DNA, der sekventeres, kan ikke være længere end 1000 basepar
- Kun en streng kan sekventeres ad gangen.
- Processen er tidskrævende og dyr.
Derfor blev nye avancerede sekventeringsteknikker udviklet med tiden til at overvinde disse problemer. Sanger-sekventering er dog stadig i brug på grund af dets meget nøjagtige resultater op til ca. 850 basepar-længde fragmenter.
Hvad er Pyrosequencing?
Pyrosequencing er en ny DNA-sekventeringsteknik baseret på "sekventering ved syntese". Denne teknik er afhængig af påvisning af pyrophosphatfrigivelse ved nukleotid-inkorporering. Fremgangsmåden anvendes af fire forskellige enzymer: DNA-polymer, ATP-sulfurylase, luciferase og apyrase og to substrater adenosin 5'-phosphosulfat (APS) og luciferin.
Processen starter med primerbinding med den enkeltstrengede DNA-skabelon, og DNA-polymerase starter inkorporeringen af nukleotider komplementære til den. Når nukleotiderne samles (nucleinsyrepolymerisation) frigiver det pyrophosphat (to phosphatgrupper bundet sammen) grupper og energi. Hver nukleotidtilsætning frigiver ækvimolær mængde pyrophosphat. Pyrophosphat omdannes til ATP med ATP-sulfurylase i nærværelse af substrat APS. Den genererede ATP driver den luciferasemedierede omdannelse af luciferin til oxyluciferin og frembringer synligt lys i mængder, der er proportional med mængden af ATP'er. Lys detekteres af en fotodetekteringsenhed eller af en fotomultiplikator og skaber et pyrogram. Apyrase nedbryder ATP og ikke-inkorporerede dNTP'er i reaktionsblandingen. dNTP-tilføjelse udføres én gang ad gangen. Da tilsætningen af nukleotid er kendt i henhold til inkorporering og detektion af lys, kan skabelonets rækkefølge bestemmes. Pyrogram anvendes til generering af nukleotidsekvensen af prøven-DNA som vist i figur 03.
Pyrosequencing er meget vigtig ved analyse af enkelt nukleotid-polymorfisme og sekventering af korte DNA-strækninger. Den høje nøjagtighed, fleksibilitet, lethed af automatisering og parallel behandling er fordelene ved pyrosekventering i forhold til Sanger-sekventeringsteknikker.
Figur 03: Pyrosequencing
Hvad er forskellen mellem Sanger Sequencing og Pyrosequencing?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing | |
| Sanger-sekventering er en DNA-sekventeringsmetode baseret på den selektive inkorporering af ddNTP'er ved hjælp af DNA-polymerase og kædeterminering. | Pyrosequencing er en DNA-sekventeringsmetode baseret på påvisning af pyrophosphatfrigivelse efter inkorporering af nukleotid. |
| Brug af ddNTP | |
| ddNTP'er bruges til at afslutte DNA-replikationen | ddNTP'er bruges ikke. |
| Involverede enzymer | |
| DNA-polymerase anvendes. | Fire enzymer anvendes: DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, Luciferase og Apyrase. |
| Brugte underlag | |
| APS og Luciferin bruges ikke. | Adenosin 5 'phosphosulfat (APS) og luciferin anvendes. |
| Maksimal temperatur | |
| Dette er en langsom proces. | Dette er en hurtig proces. |
Resume - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-sekventering og Pyrosequencing er to DNA-sekventeringsmetoder, der anvendes i molekylærbiologi. Sanger-sekventering konstruerer nukleotidernes rækkefølge i rækkefølge ved at afslutte kædeforlængelsen, mens pyrosekvænkningen konstruerer den nøjagtige rækkefølge af nukleotiderne i rækkefølge ved inkorporering af nukleotider og detektering af frigivelsen af pyrophosphater. Derfor er den største forskel mellem Sanger-sekventering og Pyrosequencing, at Sanger-sekventering fungerer på sekventering ved kædeafslutning, mens pyrosekventering fungerer ved sekventering ved syntese.
Reference:
1. Fakruddin, Md og Abhijit Chowdhury. “Pyrosequencing-et alternativ til traditionel Sanger Sequencing.” American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Science Publications, 2. mar. 2012. Web. 28. februar 2017.
2. "Sanger sequencing." Sanger sequencing - ScienceDirect Theme. N.p., n.d. Web. 28. februar 2017
Billede høflighed:
1. “Didesoxy-Methode” Af Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, på grundlag af en dato fra Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. “Sanger-DNA-seq” af Enzo på det polske sprog Wikipedia (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. “Pyrosequencing” af mikrobiologi-byte (CC BY-SA 2.0) via Flickr
