Forskellen mellem varm og kold trypsinisering

Nøgleforskel - Varm vs Kold trypsinisering
 

Varm og kold trypsinisering er to metoder, der anvendes til enzymatisk opdeling af celler i dyrecelleavl. Det vigtigste forskel mellem varm og kold trypsinisering, som navnene antyder, afhænger af temperaturen, hvorpå trypsin tilføjes til cellulær opdeling. Varm trypsinisering finder sted under forhold ved højere temperatur (36,5 - 37 ⁰C) hvorimod kold trypsinisering finder sted under lave temperaturforhold.

Under processen med primær cellekultur af dyreceller er der tre hovedmetoder anvendt og har vist sig at være vellykkede. De tre metoder inkluderer mekanisk opdeling af celler, enzymatisk opdeling af celler og den primære eksplanteringsmetode. Den enzymatiske opdeling af celler, der fører til isolering af celler, og den udføres af det protein-nedbrydende enzym trypsin. Derfor er denne proces kendt som Trypsinization. Trypsinisering kan udføres under to forskellige betingelser, nemlig varm Trypsinization og Cold Trypsinization. Varm trypsinisering er fremgangsmåden til behandling af cellerne med trypsin under varme forhold ved en temperatur på 36,5 - 37 ⁰C. Kold trypsinisering er processen med trypsinbehandling, der finder sted under koldere betingelser, fortrinsvis i is, der holder meget lave temperaturer.

INDHOLD

1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er varm Trypsinization
3. Hvad er kold trypsinisering
4. Ligheder mellem varm og kold trypsinisering
5. Sammenligning side ved side - varm vs kold trypsinisering i tabelform
6. Resume

Hvad er varm Trypsinization?

Trypsinisering kan udføres for at adskille de cellulære komponenter for at isolere cellerne til at producere en primær cellekultur. Trypsin er et proteinnedbrydningsenzym, og den enzymblanding, der anvendes til trypsinisering, kan enten være en råekstrakt eller et oprenset produkt. Det antages, at råekstrakten er mere effektiv i proteinlys og celledisintegration, da den indeholder andre nedbrydende enzymer.

Varm trypsinisering er den mest almindeligt anvendte enzymatiske metode til celleopdelingen, der finder sted under forhold ved højere temperatur. Før behandlingen ved trypsinisering hugges det ønskede væv i mindre stykker. Det letter den lette opdelingsproces. Det hakkede væv vaskes derefter i et specielt medium kendt som Dissection Basal Salt medium.

Efter afslutning af vasketrinnet transformeres cellerne til en kolbe indeholdende det aktive enzym, der er trypsin. Da denne teknik indebærer en varm trypsiniseringsprotokol, anbringes trypsin ved en temperatur på ca. 37 ⁰C i cirka fire timer.

Figur 01: Trypsin

Indholdet blandes og omrøres ved anvendelse af centrifugeringsmetoder for at lette protokollen og for at fremskynde opdelingsprocessen. Når den anbefalede tid er opnået, kan cellerne afledes fra supernatanten. Cellerne afledt fra supernatanten inkuberes derefter ved en bestemt temperatur og tidspunkt.

Hvad er kold trypsinisering?

Kold trypsinisering er den anden type trypsinisering, der finder sted under kolde forhold. I denne teknik anbringes cellerne, der hugges og vaskes, i hætteglas på is og derefter gennemvædes med trypsin. Opblødningsperioden er meget længere - ca. 6 - 24 timer.

Efter afslutning af blødgøringsproceduren fjernes trypsin fra cellelysatet, og vævstykkerne inkuberes yderligere ved 37 ° C. ⁰C i ca. 20 - 30 minutter. Opdelingen af ​​cellerne frembringes ved gentagen pipettering af vævsblandingen. Dette tillader cellerne at adskille sig fra membranen og komme til supernatanten. Når cellerne først er i supernatanten, inkuberes de og dyrkes ved en ønsket temperatur og tidsperiode.

Den kolde trypsiniseringsmetode har flere fordele

• Højere udbytte af levedygtige celler, da celleskadene minimeres. Cellebeskadigelsen minimeres ved ikke at bruge centrifugeringstrin.
• Meget praktisk metode.
• Mindre arbejdskrævende.

Den største begrænsning af den kolde trypsiniseringsmetode er, at store mængder ikke kan bruges i et tilfælde.

Hvad er ligheden mellem varm og kold trypsinisering?

• Både varme og kolde trypsiniseringsprocesser bruger enzymet trypsin til opdeling af celler.
• Både varme og kolde trypsiniseringsprocesser anvendes i cellekulturprocedurer til opdeling af celler.
• I både varm og kold Trypsinization-behandlingsprocedurer er cellerne afledt fra supernatanten.

Hvad er forskellen mellem varm og kold trypsinisering?

Varm vs kold trypsinisering
Varm trypsinisering er fremgangsmåden til behandling af cellerne med trypsin under varme forhold ved en temperatur på 36,5 - 37 0.	Kold trypsinisering er processen med trypsinbehandling, der finder sted under koldere betingelser, fortrinsvis i is, der holder meget lave temperaturer.
protokol
De hakkede vævstykker holdes ved 37 0C kontinuerligt under hele proceduren.	De hakkede vævstykker opretholdes oprindeligt ved iskoldt temperatur og holdes derefter ved 37 0.
Temperatur
Varm trypsinisering sker ved 36,5 - 37 0	Kold trypsinisering forekommer ved iskold temperatur.
Tid forbrugt
Mindre tid kræves til hele processen (ca. 4 timer) med varm trypsinisering.	Det kræver længere tid (ca. 6 - 24 timer) til kold trypsinisering.
Udbytte af levedygtige celler
Lav i varm trypsinisering.	Høj i kold trypsinisering.
Brug af centrifugering
Centrifugering er påkrævet for opdeling af celler i varm trypsinisering.	Centrifugering er ikke påkrævet ved kold trypsinisering.
Indledende vævsmængde til Trypsinization
En større mængde væv kan bruges til varm trypsinisering.	En mindre mængde væv kan bruges til kold trypsinisering.
Cellebeskadigelse
Høj på grund af centrifugering i varm trypsinisering.	Mindre på grund af kold trypsinisering.

Resumé - Varm vs Kold trypsinisering

Trypsinisering er fremgangsmåden til anvendelse af det proteinnedbrydende enzym trypsin til opdelingen og fremstilling af primære cellekulturer under cellekulturprocessen. Der er to hovedteknikker til trypsinisering baseret på temperaturerne anvendt under proceduren. De er varme og kolde trypsinisering. Varm trypsinisering udføres kl. 37 ⁰C hvorimod kold trypsinisering udføres under iskoldt forhold. Selvom kold trypsinisering tager længere tid for færdiggørelse siges det at have et højere udbytte af levedygtige celler. Dette skyldes det faktum, at celleskader minimeres ved kold trypsinisering, da den ikke bruger kraftige centrifugeringstrin. Dette er forskellen mellem varm og kold trypsinisering.

Reference:

1. ”Trypsinisering.” Trypsinization - en oversigt | ScienceDirect-emner. Tilgængelig her 
2. "Primær cellekultur: 3 teknikker (med diagram)." Biologisk diskussion, 16. oktober 2015. Tilgængelig her  

Billede høflighed:

1.'Trypsin aktive side'By Fdardel - Eget arbejde, (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia