Forskel mellem PCR og DNA-sekventering
Share
Nøgleforskel - PCR vs DNA-sekventering
PCR og DNA-sekventering er to vigtige teknikker inden for molekylærbiologi. Polymerase Chain Reaction (PCR) er processen, der skaber et stort antal kopier af et DNA-fragment. DNA-sekventering er den teknik, der resulterer i den nøjagtige rækkefølge af nukleotiderne i et givet DNA-fragment. Dette er den vigtigste forskel mellem PCR og DNA-sekventering. PCR er et af de vigtigste trin involveret i DNA-sekventering.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er PCR
3. Hvad er DNA-sekventering
4. Sammenligning side ved side - PCR vs DNA-sekventering
5. Resume
Hvad er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en DNA-amplifikationsteknik, der anvendes i molekylærbiologi. Det producerer tusinder til millioner af kopier af et bestemt DNA-fragment. Denne metode blev udviklet af Kary Mullis i 1983. I denne teknik tjener fragmentet af DNA, der skal amplificeres, som templaten, og DNA-polymeraseenzym tilføjer komplementære nukleotider til primeren, der er tilgængelig i PCR-blandingen. Ved afslutningen af PCR-reaktionen syntetiseres mange kopier af DNA-prøven.
Der er forskellige komponenter i PCR-blandingen, herunder DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primere (fremadgående og bagudgående primere), nukleotider (byggesten af DNA) og en puffer. PCR sker inden i en PCR-maskine, og den korrekte PCR-blanding skal indlæses i maskinen, og det korrekte program skal køres. Denne teknik muliggør produktion af tusinder til millioner af kopier af en bestemt sektion af DNA fra en meget lille mængde DNA.
PCR-reaktioner forekommer på en cyklisk måde til frembringelse af den synlige mængde PCR-produkter på en gel. Der er tre hovedtrin involveret i en PCR-reaktion, nemlig denaturering, primerglødning og strengforlængelse som vist i figur 01. Disse tre trin forekommer ved tre forskellige temperaturer. DNA findes i dobbeltstrenget form af hydrogenbindinger mellem de komplementære baser. Før implikation skal dobbeltstrenget DNA skilles fra hinanden. Det gøres ved at give en høj temperatur. Ved en høj temperatur denaturerer dobbeltstrenget DNA i enkeltstrenge. Derefter skulle primerne komme tættere på de flankerende ender af det specifikke fragment eller DNA'ets gen. Primer er et kort stykke enkeltstrenget DNA, der er komplementært til målsekvensen. Fremadrettede og bagudgående primere anneales med de komplementære baser ved de flængende ender af detatureret prøve-DNA ved udglødningstemperaturen. Primere skal være varmebestandige. Når primere anneales med prøve-DNA, initierer taq-polymeraseenzym syntesen af de nye strenge ved at tilføje nukleotider, der er komplementære til mål-DNA'et. Taq-polymerase er et varmestabilt enzym isoleret fra en termophil bakterie kaldet Thermus aquaticus. PCR-buffer opretholder de optimale betingelser for taq-polymeraseaktionen. Disse tre trin af PCR-reaktioner gentages for at producere den krævede mængde PCR-produkt. Efter hver PCR-reaktion fordobles antallet af DNA-kopien. Derfor kan en eksponentiel amplifikation observeres i PCR. PCR-produkter kan observeres under anvendelse af gelelektroforese og kan oprenses til yderligere undersøgelser.
Figur 01: Store trin i en PCR-reaktion
PCR er et værdifuldt værktøj inden for medicinsk og biologisk forskning. PCR har en særlig værdi inden for retsmedicinsk videnskab, da den kan forstærke DNA til undersøgelser fra de små prøver fra de kriminelle og fremstille retsmedicinske DNA-profiler. PCR bruges i vid udstrækning inden for mange områder af molekylærbiologi, herunder genotyping, genkloning, mutationsdetektion, DNA-sekventering, DNA-mikroarrays og faderskabstestning, osv..
Figur 02: Polymerasekædereaktion
Hvad er DNA-sekventering?
DNA-sekventering er bestemmelsen af en nøjagtig rækkefølge af nukleotiderne - adenin, guanin, cytosin og thymin i et givet DNA-fragment. Genetisk information gemmes i DNA-sekvenserne ved anvendelse af den rigtige rækkefølge af nukleotiderne. Derfor er det at finde den nøjagtige rækkefølge af nukleotiderne i et DNA-fragment meget vigtigt at vide om genens struktur og funktion.
DNA-sekventeringsprotokol involverer forskellige processer. Det første trin er isoleringen af interesseret DNA eller genomisk DNA fra en organisme. Ved anvendelse af PCR (som beskrevet ovenfor) skal den ønskede region af DNA amplificeres. Amplificeret PCR-produkt skal adskilles ved gelelektroforese og oprenses. Forstærkede fragmenter serveres som skabeloner til sekventering. Sekventering kan udføres enten efter Sanger-sekventering eller sekvenseringsmetode med høj kapacitet. Sanger-sekventering kræver kapillær elektroforese af resulterende DNA-fragmenter. Bestemmelse af den korrekte nukleotidrekkefølge kan udføres ved manuel læsning af autoradiografer eller ved hjælp af automatiserede DNA-sekventer.
Gensekventering bidrog til humant genomprojekt og lettede kortlægningen af det humane genom i 2003. I retsmedicin aktiverede DNA-sekventering identifikation af individer, der viser unikke DNA-sekvenser og identificerer de kriminelle. Inden for medicin kan DNA-sekventering bruges til at detektere de gener, der er ansvarlige for genetiske sygdomme og andre sygdomme, finde defekte gener og erstatte dem med korrekte gener. I landbruget bruges DNA-sekventeringsinformation af nogle mikroorganismer til at producere transgene afgrøder med økonomisk ønskede egenskaber.
Figur 03: DNA-sekventering
Hvad er forskellen mellem PCR og DNA-sekventering?
PCR vs DNA-sekventering | |
| PCR-processen skaber tusinder til millioner af kopier af det interesserede DNA-fragment. | DNA-sekventering er processen til bestemmelse af den nøjagtige rækkefølge af nukleotiderne i et givet DNA-fragment. |
| Resultat | |
| PCR skaber tusinder til millioner af kopier af et bestemt DNA-fragment | Dette resulterer i den korrekte rækkefølge af baserne i et bestemt DNA-fragment. |
| Inddragelse af ddNTP'er | |
| PCR kræver ikke ddNTP'er. Det bruger dNTP'er. | DNA-sekventering kræver ddNTP'er for at afslutte dannelse af streng. |
Resume - PCR vs DNA Sequencing
PCR og DNA-sekventering er meget vigtige værktøjer inden for mange områder af molekylærbiologi. Amplifikation af DNA-fragmenterne udføres ved PCR-teknik, medens den korrekte rækkefølge af nukleotiderne i et DNA-fragment bestemmes ved DNA-sekventeringen. Dette er forskellen mellem PCR og DNA-sekventering.
Reference:
1. "Polymerase Chain Reaction (PCR)." National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine, n.d. Web. 21. februar 2017.
2. Shendure, Jay og Hanlee Ji. "Næste generation af DNA-sekventering." Naturnyheder. Nature Publishing Group, 9. oktober 2008. Web. 21. februar 2017
Billede høflighed:
1. “PCR Steps” Af Tinojasontran - Eget arbejde (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. “Polymerasekædereaktion” Af Enzoklop - Eget arbejde (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "DNA-sekvens" Af Sjef - Eget arbejde (Public Domain) via Commons Wikimedia
