Forskel mellem PCR-primere og sekventeringsprimere
Share
Nøgleforskel - PCR Primers vs Sekventering primere
Med den nylige udvikling inden for molekylærbiologi blev der udviklet forskellige genetiske teknikker, der gjorde undersøgelsesprocesserne for forskellige veje i emnet let og nøjagtigt. PCR og andre sekventeringsprocedurer er to vigtige sådanne teknikker. De bruger forskellige underkomponenter. Primere betragtes som den vigtigste underkomponent, der er fælles for både PCR og sekventeringsteknikker. PCR-primere anvendes til amplificering af en bestemt DNA-sekvens, mens sudligningsprimere anvendes i sammenhæng med sekventering af et DNA-fragment med den hensigt at afsløre dens specifikke rækkefølge af nukleotidsekvensen. Dette er vigtigste forskel mellem PCR-primere og sekventeringsprimere.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er PCR-primere
3. Hvad er sekventeringsgrunde
4. Ligheder mellem PCR-primere og sekventeringsprimere
5. Sammenligning side ved side - PCR-primere vs sekventeringsgrunder i tabelform
6. Resume
Hvad er PCR-primere?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en genetisk teknik, der anvendes inden for molekylærbiologisk område for at amplificere en enkelt eller få kopier af et bestemt DNA-segment og for at få mange millioner identiske kopier. I en PCR-reaktion anvendes forskellige komponenter inklusive primere. Primere er korte DNA-strenge med en nukleotidlængde på 18-25, hvilket gør dem kompatible med start- og slutregionen af DNA-fragmenterne, der skal amplificeres. Primere kan være en forreste primer og reverse primer. Disse primere binder til DNA-fragmentet på de specifikke punkter, hvor det gør DNA-polymerase til at binde til den specifikke primer på stedet og initierer syntesen af den nye DNA-streng.
Valget af primere er et vigtigt aspekt af PCR-processen. Valg af længde på grunden er vigtig. Den ideelle længde ville være 18-25 nukleotider. Hvis længden er for kort eller for lang, binder primerne ikke sig til DNA-sekvensen, der skal amplificeres nøjagtigt. Primere, der er for korte i længden, fører til ikke-specifik primerglødning på forskellige steder af DNA-sekvensen.
Figur 01: PCR-primere
Indholdet af guanin og cytosin (GC) i en god grunning bør være i området 40-60. Primerglødningstemperatur og smeltetemperatur er vitale faktorer under PCR. Smeltetemperaturen skal beregnes nøjagtigt, og temperaturen til grundglødning bør være 5 0C mindre end smeltetemperaturen. Smeltetemperaturen skal være 60 ° C og 75 ° C. For høje eller for lave temperaturer vil resultere i mindre aktiv DNA-polymeraseaktivitet.
Hvad er sekventeringsgrunde?
Sekventeringsprimere bruges i sammenhæng med sekventering af et DNA-fragment med det formål at afsløre dets specifikke identitet. For at opnå gode sekvenseringsresultater er primere og skabeloner af høj kvalitet vigtige. Når primere er valgt, bør de således være unikke for et bestemt område, hvor vi ønsker at sekvensere. Det skal også være med en korrekt orientering, hvor sekvenserne normalt genereres fra 3 'til 5' ender af primerne. Sekvensen skal være manglende uønsket selvhybridisering, såsom dannelse af hårnålslynge. Det bør ikke indeholde sammenhængende dannelse af Guanine-baser.
Grunningens smeltetemperatur (Tm) skal være egnet til betingelserne for sekventering. Derfor bør det ligge mellem 52oC og 74oC. Fremstilling af oligonukleotider til anvendelse som en primer bør renses for at opnå den ønskede fuld længde af sekvensen. Hvis oligonukleotiderne indeholder urenheder, overføres primersekvenssignaleringen fra forskellige grundsteder, og det reducerer også antallet af baseceller.
Figur 02: Sekventeringsprimere
Primer-smeltetemperatur (Tm) af et oligonukleotid bestemmer, hvor stærk de komplementære DNA-strenge hybridiseres med hinanden. Tm kan betragtes som en termodynamisk beregning, hvor den er afhængig af både DNA-sekvenser og adskillige betingelser, såsom saltkoncentration. Tm er vigtig under PCR, hvor en variant, der kaldes cyklussekventeringen, bruges til at fremstille en gruppe dideoxynukleotid-terminerede fragmenter. Her annulleres primeren, der er sekventeret, alternativt, derefter forlænget og til sidst denatureret til amplifikation. Derfor bør Tm-værdien ligge mellem 52oC og 74o C. Syntetiserede oligonukleotider kan opnås fra DNA / RNA-syntese laboratorier som per valg. Den lille syntese, der bruges til DNA-sekventering, er normalt 50 nmol. Også vigtigst bør primerne, der anvendes til sekventering, renses for at være fri for urenheder, der forhindrer kvalitetsreduktion.
Hvad er ligheden mellem PCR-primere og sekventeringsprimere?
- Både PCR-primere og sekventeringsprimere er primere, der anvendes i amplificeringsprocessen for en målrettet DNA-sekvens.
- Både PCR-primere og sekventeringsprimere er sammensat af nukleotider.
- Både PCR-primere og sekventeringsprimere er korte oligomerer.
Hvad er forskellen mellem PCR-primere og sekventeringsprimere?
PCR Primere vs Sequencing Primers | |
| PCR-primere er korte DNA-strenge med en nukleotidsekvenslængde på 18-25, hvilket gør dem kompatible med start- og slutregionen af DNA-fragmenterne, der skal amplificeres. | Sekventeringsprimere er korte oligomerer, der bruges i forbindelse med sekventering af et DNA-fragment med det formål at afsløre dets specifikke identitet. |
| Fungere | |
| PCR-primere bruges til amplificering af en bestemt DNA-sekvens. | Sekventeringsprimere bruges i sammenhæng med sekventering af et DNA-fragment med det formål at afsløre dets specifikke identitet. |
| Antal nødvendige primere | |
| To primere; en fremadrettet primer og en omvendt primer anvendes som PCR-primere. | Brug for kun en primer som sekventeringsprimer. |
Resumé - PCR-primere vs Sekventering primere
Sekventeringsprimere bruges i sammenhæng med sekventering af et DNA-fragment med det formål at afsløre dets specifikke identitet. En sekventeringsprimer vil være nok til at køre processen. For at opnå gode sekventeringsresultater er primere og skabeloner af høj kvalitet vigtige. Når primere er valgt, bør de således være unikke for et bestemt område, hvor vi ønsker at sekvensere. PCR-primere er korte DNA-strenge med en nukleotidlængde på 18-25, som er kompatibel med start- og slutregionen af DNA-fragmenterne, der skal amplificeres. PCR-primere kan være en primer og revers primer. Indholdet af guanin og cytosin (GC) i en god grunning bør være i området 40-60. Primerglødningstemperatur og smeltetemperatur er vitale aspekter under PCR. Dette er forskellen mellem PCR-primere og sekventeringsprimere.
Reference:
1. "Polymerasekædereaktion (PCR)." Khan Academy. Tilgængelig her
2. "Sekventering af primere og grundlæggende design." Sekventeringsprimere og grunddesign | University Core DNA Services | University of Calgary. Tilgængelig her
Billede høflighed:
1.'Primers RevComp'By Zephyris - Eget arbejde, (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2.'DNA Sequencin 3 mærkningsmetoder'By Abizar (original uploader) på engelsk Wikipedia - Overført af Gustavocarra., (Public Domain) via Commons Wikimedia
