Forskellen mellem RT PCR og QPCR

Nøgleforskel - RT PCR vs QPCR
 

Polymerase-kædereaktion er en teknik, der anvendes til at amplificere en specifik DNA-region in vitro. På grund af opfindelsen af ​​denne teknik af Kary Mullis i 1983 er forskere i stand til at fremstille tusinder til millioner af kopier af specifikke DNA-fragmenter til forskningsformål. I øjeblikket er det blevet en almindelig og rutinemæssigt udført teknik i kliniske laboratorier og forskningslaboratorier til en lang række anvendelser. Der er variationer af traditionel PCR-teknik, såsom RT PCR, indlejret PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT - QPCR osv. RT PCR og Q PCR er to vigtige variationer af PCR. Den vigtigste forskel mellem RT PCR og Q PCR er den RT PCR bruges til at detektere genekspression gennem oprettelse afkomplementært DNA (cDNA) transkripter fra RNA mens Q PCR bruges til kvantitativt at måle PCR-produkterne i realtid ved hjælp af fluorescerende farvestoffer.

INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er RT PCR
3. Hvad er QPCR
4. Sammenligning side ved side - RT PCR vs QPCR
5. Resume

Hvad er RT PCR?

Reverse transkriptionspolymerasekædereaktion (RT PCR) er en variant af PCR, der bruges til at detektere RNA-ekspression. Det er en meget vigtig metode til påvisning af mRNA-ekspression i væv. RT PCR anvendes, når udgangsmaterialet i prøven er RNA. I RT PCR konverteres skabelon-mRNA først til komplementært DNA. Dette trin katalyseres af enzymet revers transkriptase, og processen er kendt som revers transkription. For det andet anvendes traditionel PCR til det nyligt syntetiserede cDNA til amplificeringen.

RT PCR er en meget følsom teknik, som kræver en relativt lille mængde RNA-prøve. RT PCR bruges ofte til diagnosticering og kvantificering af RNA-arter, især RNA-vira, såsom human immundefektvirus og hepatitis C-virus.

Figur 01: RT PCR-teknik

Hvad er QPCR?

Kvantitativ PCR (QPCR) er en variant af PCR, der bruges til kvantitativ måling af PCR-produkterne. Det omtales også som realtids-polymerasekædereaktion, da den måler amplificeringen af ​​realtid ved hjælp af realtid PCR-maskine. Det er en egnet metode til bestemmelse af mængden af ​​en målsekvens eller gen til stede i en prøve. Det interessante ved QPCR er, at det kombinerer både amplificering og ægte kvantificering i et enkelt trin. Derfor kan behovet for gelelektroforese i detektion fjernes ved hjælp af QPCR-teknik. QPCR bruger fluorescerende farvestoffer til at mærke PCR-produkter under PCR-reaktionerne, som til sidst fører til direkte kvantificering. Når PCR-produkterne akkumuleres, akkumuleres også fluorescerende signaler, og de måles af realtidsmaskinen. QPCR kan kombineres med RT PCR. Det er kendt som RT - QPCR eller QRT - PCR og betragtes som en mest kraftfuld, følsom og kvantitativ metode til påvisning af RNA niveauer i celler eller væv.

SYBR Green og Taqman er to metoder, der anvendes til at detektere eller se amplifikationsprocessen i realtid PCR. SYBR-grøn metode udføres ved anvendelse af et fluorescerende farvestof kaldet SYBR-grønt og detekterer amplificeringen ved at binde farvestoffet til at producere dobbeltstrenget DNA. Taqman udføres ved hjælp af dobbeltmærkede sonder og detekterer amplifikationen ved nedbrydning af proben ved Taq-polymerase og frigørelser af fluoroforen som vist i figur 02. Begge metoder overvåger forløbet af amplificeringsprocessen og rapporterer mængden af ​​produktet i realtid.

Realtid PCR har en lang række anvendelser, såsom genekspressionskvantificering, mikroRNA og ikke-kodende RNA-analyse, SNP-genotype, påvisning af kopienummervarianter, påvisning af sjældne mutationer, påvisning af genetisk modificerede organismer, påvisning af infektionsmidler, osv..

Figur 02: Kvantitativ PCR-teknik

Hvad er forskellen mellem RT PCR og QPCR?

RT PCR vs QPCR
RT PCR er en teknik, der anvendes til at detektere genekspression ved amplifikation.	QPCR er en teknik, der amplificerer DNA og kvantificerer PCR-produkter i realtid.
Inddragelse af omvendt transkriptaseenzym
Enzym revers transkriptase anvendes til RT PCR.	Enzym revers transkriptase bruges ikke til QPCR.
Anvendelse af fluorescerende mærkede molekyler
Fluorescerende mærkede farvestoffer eller sonder anvendes ikke til RT PCR.	Fluorescerende mærkede farvestoffer eller sonder anvendes til QPCR.
Kvantificering af PCR-produkt
Medmindre det er koblet med QPCR, kvantificerer RT PCR ikke PCR-produktet.	QPCR måler PCR-produktet kvantitativt.
Udgangsmateriale
Udgangsmateriale er mRNA.	Udgangsmateriale er DNA.
Syntese af cDNA
Komplementært DNA produceres under RT PCR.	Komplementært DNA produceres ikke under QPCR.

Resume - RT PCR vs QPCR

RT PCR og QPCR er to versioner af traditionel PCR. RT PCR-teknik udføres til mRNA-prøver, og den drives af revers transkription og produktion af cDNA. QPCR bruges til at kvantificere PCR-produkter i realtid PCR-termiske cyklusser ved hjælp af fluorescerende farvestoffer eller mærkede sonder. I QPCR er mængden af ​​PCR-produkt repræsenteret af de udsendte fluorescerende signaler af prøven. RT PCR bruges populært som en amplifikationsproces, mens QPCR ofte bruges som en kvantificeringsproces. Dette er forskellen mellem RT PCR og QPCR.

Referencer:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo og GK Agrawal. "Real-Time PCR: Revolutionerende detektion og ekspressionsanalyse af gener." Nuværende genomik. Bentham Science Publishers Ltd., juni 2007. Web. 3. april 2017
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh og Jo Vandesompele. "Enkel og følsom RT-qPCR-baseret genekspressionsanalyse af FFPE-prøver." Naturnyheder. Nature Publishing Group, 22. februar 2016. Web. 3. april 2017
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon og C. Mathieu. "Brug af realtid-omvendt transkriptase-PCR til kvantificering af cytokingenekspression." Journal of Biomolecular Techniques: JBT. Association of Biomolecular Resource Facilities, mar. 2003. Web. 3. april 2017

Billede høflighed:
1. “Taqman” Af bruger: Braindamaged - Eget arbejde af den originale uploader (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. “Reverse transkriptionspolymerasekædereaktion” Af Jpark623 - Eget arbejde (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia